上海安亭科學(xué)儀器廠在本文中介紹離心機(jī)在五苓散同方湯劑缺失化學(xué)成分藥效的研究中的應(yīng)用,文中先從本次實(shí)驗(yàn)所需要的實(shí)驗(yàn)材料儀器出發(fā),并簡單介紹下實(shí)驗(yàn)方法,闡明五苓方小劑量散劑臨床療效遠(yuǎn)強(qiáng)于其大劑量湯劑即五苓方宜散不宜湯的物質(zhì)基礎(chǔ),對五苓方臨床應(yīng)用的劑型選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
1、實(shí)驗(yàn)材料
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:大鼠,SPF 級,體重 180 ~ 200 g,雄性,56 只,由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號 :SCXK(遼)2015-0001,合格證編號 :211002300010439,標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件,溫度:28 ~ 30 ℃ ,相對濕度 :(55±5)%,光照 :12 h /d。
2、所需要儀器設(shè)備
23- 乙酰澤瀉醇 B(111846-201203)、香豆素(111739-200501)、 麥 角 甾 醇(111846-201203)均購自中國食品藥品檢定研究院 ;氫氯噻嗪(簡稱HCT, CAS 號 :58-93-5,SIGMA-ALDRICH),AQP1(PB0498)、AQP2 (BA0649)、AQP4 (PB0500) 抗體及羊抗兔抗體(KGAA35)均購自博士德生物技術(shù)有限公司 ;全蛋白提取試劑盒(中國 江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司 KGP250);SDP-PAGE 凝膠電泳試劑盒(中國 江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公 司 KGP113),Western Blotting 檢 測 試 劑 盒( 中國 江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司 KGP1201);ECL 檢測試劑盒(中國江蘇凱基生物科技發(fā)展有限 公 司 KGP1123);Trizol( 美 國 Invirrogen 15596-026);cDNA 第一鏈合成試劑盒(美國 Thermo FisherK1622)等。Real time PCR Master Mix (日本 TOYOBO);高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠TGL-20bR);酶標(biāo)儀(美國BioTek EL-x800);熒光定量 PCR 循環(huán)儀(美國 ABIStep one plus Real time-PCR system);分析天平(德國 Sartorius BL310/BL21S)等。
3、實(shí)驗(yàn)方法
將篩選合格的48只大鼠,分為6組,每組8只。正常大鼠的鹽水負(fù)荷模型參考文獻(xiàn)方法,并相應(yīng)改進(jìn)。正常組 :無處理,自由飲水 ;模型組 :灌胃1 % 的鹽水 2.5 ml ;麥角甾醇組(35 mg/kg):灌胃與含有麥角甾醇的等量鹽水 ;香豆素組(50 mg/kg):灌胃與含有香豆素的等量鹽水 ;23- 乙酰澤瀉醇B組(50mg/kg):灌胃與含有23- 乙酰澤瀉醇 B 的等量鹽水 ;氫氯噻嗪組(10mg/kg):灌胃與含有氫氯噻嗪的等量鹽水。每只代謝籠放 1 只大鼠,給藥體積為 25 ml/kg, 1 次 /d,連續(xù)灌胃給藥 8 d,給藥第 1 天及第 7 天將大鼠置于代謝籠內(nèi)收集給藥后 6 h 內(nèi)的尿液,并記錄尿液體積 ;第8天給藥1h后,按50mg/kg,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后,取腎臟,一份置于液氮罐中速凍后,置 -80℃冰箱保存 ;一份固定保存。檢測指標(biāo) :尿量及腎臟 AQP1、AQP2、AQP4 mRNA 和蛋白表達(dá)。
Real-time PCR 檢 測 AQP1、AQP2 和 AQP4mRNA 的表達(dá),按 Trizol 試劑說明提取細(xì)胞總 RNA,采用 MMLV逆轉(zhuǎn)率試劑盒操作說明逆轉(zhuǎn)錄 cDNA,在 95 ℃ 10min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40 cycles 反應(yīng)條件下進(jìn)行熒光定量 PCR 反應(yīng)。結(jié)果以 qrGAPDH 為內(nèi)參,采用 2 -ΔΔCT SD 法進(jìn)行結(jié)果分析,將各組 RQ 值(RQ = 2 -ΔΔCT SD)進(jìn)行比較。
統(tǒng)計(jì)分析 :使用 Gel-Pro32 軟件對結(jié)果進(jìn)行灰度分析 ;實(shí)時(shí)熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用 2 -ΔΔCT 的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 SPSS 20.0 分析軟件進(jìn)行分析,組間比較采用ANOVA 單因素方差分析,采用 LDS t-test 分析方法進(jìn)行兩兩比較,P < 0.05 認(rèn)為有顯著差異,P < 0.01認(rèn)為有極顯著差異。
以上內(nèi)容僅供大家參考。